بررسی اثر درمانی سلولهای بنیادی مزانشیمی درسرنوشت حاملگی در مدل موشی مستعد سقط

مقدمه: سلول های بنیادی مزانشیمی (mscs) را از بافت های مختلفی می توان بدست آورد. این سلول ها قادرند به نواحی التهابی مهاجرت نموده و با ترشح عوامل محلول مختلف و همچنین تماس مستقیم سلول به سلول اثر ایمونومدولاتوری از خود نشان دهند. با عنایت به این خصوصیات، کاربرد سلول های mscs در حفاظت پیوند آلوژنیک، درمان بیماری های خود ایمن و بهبود برخی از بیماری های دژنراتیو مورد توجه قرار گرفته است. نارسائیهای ایمونولوژیک یکی از علل عمده ابتلا به سقط های مکرر می باشد. به نظر می رسد سلولهای بنیادی مزانشیمی با خاصیت ایمونومودولاتوری خود قادرند بسیاری از نارسائیهای ایمونولوژیک مسبب سقط را به حالت طبیعی بر گردانند. مدل حیوانی مناسب برای مطالعه سقط های مکرر با منشاء ایمونولوژیک از جفت گیری موش های نژاد خالص cba/j ماده و dba/2 نر پدید می آید. با عنایت به ویژگی های ایمونومدولاتوری سلول های بنیادی مزانشیمی، تاثیر سلول درمانی با این سلول ها بر میزان سقط، درصد آنتی بادی های نامتقارن در سرم و همچنین بیان mrna سیتوکین های tgf-? و 2-3 ایندولامین داکسیژناز ( ido ) در بافت دسیجوا، در مدل موشی مورد بررسی قرار گرفت. بعلاوه ردیابی سلول های بنیادی مزانشیمی در بافت های رحم، ریه و طحال پس از تزریق به حیوان با روش های مختلف انجام شد. روش ها: جهت کشت سلول های بنیادی مزانشیمی، بافت چربی ناحیه شکمی موش cba/j ماده، با آنزیم کلاژناز هضم و پلت سلولی بدست آمده در محیط dmem کشت داده شد. سلول های کشت شده حداکثر در پاساژ دوم از نظر بروز شاخصهای سطحی وتوانایی تمایز به بافت چربی و استخوان مورد ارزیابی قرار گرفتند. یک میلیون از سلول های mscs از طریق صفاقی به موش مدل سقط در روز 5/4 حاملگی تزریق شد. در روز 5/13 حاملگی، پس از خون گیری از قلب، در صد سقط در گروه کنترل و آزمون محاسبه گردید. بعلاوه بافت دسیجوا جدا و پس از استخراج rna از آن cdna تهیه گردید. درصد آنتی بادی های نامتقارن در سرم با روش الیزا و میزان بیان tgf-? و ido در دسیجوا با روش real-time pcr اندازه گیری شد. جهت ردیابی سلول های بنیادی مزانشیمی، سلول های ترانسفکت شده با لنتی ویروس حاوی ژن gfp درروز 5/4 حاملگی از طریق صفاقی تزریق گردیدند، در روز 5/6 حاملگی موش ها کشته شدند و از بافت رحم، ریه و طحال آنها نمونه های مقاطع بافتی فریز شده و پارافینه برای جستجوی سلول های gfp مثبت با مشاهده مستقیم و روش ایمونوهیستوشیمی گرفته شد. بعلاوه از بافت رحم، ریه و طحال این موش ها rna استخراج و سپس cdna سنتز شد، تا بیان ژن gfp در این بافت ها مورد بررسی قرار گیرد. از بافت های مذکور با روش هضم آنزیمی مبادرت به تهیه سلول منفرد (single cell) نیز شد تا با کشت این سلول ها و همچنین روش فلوسیتومتری، نسبت به یافتن سلول gfp مثبت اقدام شود. نتایج: مقایسه نتایج در دو گروه مورد مطالعه نشان داد که تزریق سلول های بنیادی مزانشیمی درصد سقط را بطور معنی داری نسبت به گروه کنترل، کاهش داده است، اما درصد آنتی بادی های نامتقارن در این دو گروه تغییر معنی داری را نشان نداد. بیان ژن tgf-? در دسیجوای گروه آزمون در مقایسه با گروه کنترل بیش از 4 برابر افزایش داشت در حالیکه در روز 5/13 حاملگی بیان ژن ido در هیچکدام از دو گروه مشاهده نگردید. ردیابی سلول های بنیادی مزانشیمی ترانسفکت شده با لنتی ویروس حاوی ژن gfp در مقاطع انجمادی بافت های تهیه شده منفی بود. ihc بافت پارافینه با آنتی بادی ضد gfp برای یافتن سلول gfp مثبت و همچنین فلو سیتومتری و کشت سلولهای منفرد تهیه شده از بافت ها یاد شده برای یافتن سلول gfp+ نتیجه مثبت در بر نداشت. این در حالی بود که جستجوی بیان ژن gfp در بافت رحم مثبت و در بافت های ریه و طحال منفی بود که می تواند نشانه ای از مهاجرت این سلول به رحم باشد. نتیجه گیری: بر اساس اطلاعات ما این مطالعه اولین گزارش در ارتباط با نقش درمانی سلولهای بنیادی مزانشیمی در سقط مکرر ایمونولوژیک می باشد. با توجه به پیچیدگی عوامل کنترل کننده پاسخ ایمنی مادر در طی حاملگی(مداخله انواع سلولهای سیستم ایمنی مانند: سلولهای nk, treg, dcs, mq و عوامل محلول مانند: سایتوکاینهای مختلف، کموکاینها، هورمونها،....) که منجر به فراهم آوردن محیطی مناسب و حامی برای رشد جنین نیمه آلوژنیک می گردد و با در نظر گرفتن دامنه گسترده تاثیر سلولهای بنیادی مزانشیمی که نقش ایمونومدولاتوری آن بر روی اکثر عوامل مداخله گر در تنظیم پاسخ ایمنی مادر به جنین گزارش شده است، بدیهی است که فهم مکانیزم دقیق تاثیر mscs در کاهش معنی دار درصد سقط به مطالعه جامع جنبه های مختلف سیستم دفاعی مادر نیاز دارد که بخشی از آن در غالب پروژه های مجزا در دانشگاه تربیت مدرس در حال انجام می باشد. در ارتباط با نتایج این رساله سلول های mscs به احتمال زیاد توانسته اند به کانونهای التهابی در مناطق لانه گزینی، جذب شده و با ترشح فاکتور های مختلف اثر ایمونومدولاتوری خود را القا نمایند. بیان tgf-? در دسیجوا گروه آزمون به میزان بیش از 4 برابر می تواند یکی از مکانیسم های احتمالی بهبود سرنوشت حاملگی باشد. همچنین عدم بیان ژن ido در روز 5/13 حاملگی در دو گروه را می توان مر بوط به تاخیر در زمان نمونه برداری دانست. از طرف دیگر عنوان شده است tgf-? به عنوان یکی از سیتوکاین هایی که حاملگی مطلوب را سبب می شود، می تواند از بیان ido ممانعت کند. در ضمن تزریق سلولهای بنیادی مزانشیمی تاثیری بر درصد تولید آنتی بادیهای نامتقارن نداشت. با در نظر گرفتن اینکه تولید آنتی بادی نامتقارن توسط همان پلاسما سلهایی صورت می گیرد که آنتی بادیهای معمولی را تولید می کنند و این سلولها در سرتاسر بدن بخصوص در مغز استخوان مستقر هستند، احتمالا تزریق موضعی mscs نتوانسته است تاثیر زیادی بر تولید این آنتی بادیها داشته باشد.